利用16SrRNA基（jī）因序列鑒定奶牛乳腺炎致病菌的技術方法

奶牛（niú）乳腺炎是困擾奶牛業（yè）發展的（de）四大疾病之首，是最（zuì）常見、治療花費最高的疾病之一，主要是由病（bìng）原微（wēi）生物在奶牛乳腺內感染引起的炎症反應。據統計，我國每年因乳（rǔ）房炎造成的經濟（jì）損失達135億元。可以引起奶牛乳房（fáng）炎的微生物種類有（yǒu）很多，如細菌、病毒（dú）、真菌、支原體等，目（mù）前（qián）從患有乳房炎（yán）的奶牛乳（rǔ）汁中分離到了160多（duō）種微生物，以細菌感染比較多見，引發該疾病的致病菌主要有葡萄球菌、鏈球菌（jun1）和大腸杆菌，這三種細菌引起的乳腺炎占總發病率（lǜ）的90%以上。本研究中，通過對乳腺炎患（huàn）牛乳汁的病原（yuán）菌培養、分離及藥敏試驗後（hòu），得到乳腺炎（yán）致病菌株，通（tōng）過對其16S　rRNA基因的序列進行分析，為該株致病菌的研究提供參考。

1、材料與方法

乳腺炎致（zhì）病菌（jun1）分離將乳腺炎患牛乳汁稀釋（shì）後，分別接（jiē）種到血瓊脂平板和（hé）伊紅美藍（lán）瓊脂平板上（shàng），恒溫培養，觀察記錄菌落形態、大小（xiǎo）及溶血情況（kuàng），接種到（dào）肉羊培養基中增菌培養。

分離菌株藥敏試驗將上述分離（lí）的致病菌分別接種到（dào）肉湯培養基培養，周圍黏貼藥敏片，培養（yǎng）24　h，觀察抑菌直徑。

細（xì）菌學鑒定及（jí）致病性確定采用生化與革蘭氏（shì）染色（sè）鏡檢，確定耐藥菌形態，並進行（háng）細菌學分類。抽取分離培養後的菌液500　μL，腹腔注射健康小鼠，24　h後觀察小鼠發病情況，如小鼠死亡則認定該菌株具有致病性。

細菌16S　rRNA基因克隆與測序使用細菌基因組DNA提取試劑盒對菌液進行基因組DNA的提取，後利用細菌16S　rRNA基因通用引物（F：5　7-　AGAGTTTGATCMTG-GCTCAG　-　3´;　R:5’-　TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）進行細菌16S　rRNA基因PCR擴增（擴增體積為50lJL;條件為：95℃預（yù）變性5　min，94℃變性30　s，56℃退火30　s，72℃延（yán）伸90　s，30個循（xún）環；最後72℃終延伸10　min，4℃結束反應），電（diàn）泳以及膠回收後，連接pMD　-　18T載體連接克隆，經過篩選後將有16S　rRNA基因序列插入的質粒提取測序。

序列BLAST比（bǐ）對測序後（hòu）的細菌16S　rRNA基因提交到NCBI，並利用BLAST軟件進行序列比對，

2、實（shí）驗結果（guǒ）

2..1致病菌株（zhū）篩選以及鑒定結果

本次（cì）研究從（cóng）27份乳（rǔ）腺炎患牛乳汁中分離出致病（bìng）菌19株，其中經鑒定8株為葡萄球菌（jun1），6株為（wéi）鏈球菌（jun1），5株為大腸杆菌（jun1）。將上（shàng）述分（fèn）離菌株按照0.5　mL/隻劑（jì）量腹腔注射健康小鼠，小鼠在24　h內全部死亡，因此分離菌株均有致（zhì）病性。隨機選取一株經細菌學鑒（jiàn）定為葡萄球菌的菌株，進行其16SrRNA基因擴增、克隆、測序後，進行序列分析。

2..2　　PCR擴增結果

利用細（xì）菌16S　rRNA基因通用引物擴增後，1%瓊（qióng）脂糖凝膠電（diàn）泳結果見圖1。

M:DL2000，泳道l和2為（wéi）擴增產物（wù），泳（yǒng）道3為陰（yīn）性對照

擴增後電泳圖片顯示，在（zài）1422bp處有一特異性擴增條帶（dài），與（yǔ）目的片段相符。

2..3　細菌16S　rRNA基因序（xù）列及BI．AST比對結果

將擴增的PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離後，采用DNA凝膠回收試劑盒進行回收純（chún）化，將純化的PCR產物與載體pMD-　18T連接後轉化E．coli　b121進（jìn）行（háng）克隆（lóng），經過篩選後將有16S　rRNA基因序列插入的質（zhì）粒提取測序。序列提交到NCBI，並應用BLAST軟件進行序（xù）列（liè）比對，結果顯示：該（gāi）序列與表皮葡萄球菌（jun1）(　Staphylococcus　epidermi-dis)的16S　rRNA基因（yīn）序列相似性為99%，因此本次分離的（de）菌株（zhū）為表皮葡萄球菌。

3、討論

表皮葡萄球菌是（shì）滋（zī）生於（yú）生物體表皮上的一種細菌，故名。前人對乳腺炎致病（bìng）菌研究中發現，致病菌為（wéi）葡萄球菌屬的有50.　7%為金黃色葡萄球菌，44.　8%為表皮葡萄球菌，因此表（biǎo）皮葡萄球菌是乳（rǔ）腺炎致病（bìng）的（de）重要病原菌之一[3]。

16S　rRNA基因具有高度保守的一級結構，種間（jiān）差異小（xiǎo），1995年Amann建立了以16S　rRNA基因為PCR擴增靶分子的細菌快速分類鑒定的標準（zhǔn）方法，該方法可以應用於細菌種、屬和科的鑒定及係統（tǒng）進化分析等。目（mù）前基於高通量測序的細菌（jun1）多樣性檢測（cè），其（qí）理論基礎就是基於細菌的該（gāi）片段的（de）此種特點發展而來的。

在臨床條件下，快速、有效而準確的對病原作出鑒定對乳房炎的防治是（shì）非常重（chóng）要的。運用PCR技（jì）術（shù），對乳房（fáng）炎病原菌的鑒定可以在數小時內完成，而且對種特異性16SrRNA基因擴（kuò）增具有高敏感性和特異性（xìng），從而也提高了（le）乳房炎病原（yuán）的診（zhěn）斷水平，因此可以在乳房炎病原感染的早期或者（zhě）在攜帶病（bìng）原（yuán）的（de）奶牛乳汁中僅有很少量病原菌存在時就能被檢測出來。