木糖篩選係（xì）統在蔬菜遺（yí）傳轉化上（shàng）的應用

轉化效率低和轉基因食品安全性問題一直是製約蔬菜（cài）基因工（gōng）程育種的2個主要因素。在植物的遺傳轉化中，人們將植物細胞對（duì）不同糖類分解代謝能力的（de）差異，作為篩選劑的正向選擇係統得以發展，並在安全標記基（jī）因方麵顯示出巨大的應（yīng）用潛（qián）力。

1、蔬菜遺傳轉（zhuǎn）化（huà）的（de）研究現狀及存在問題

隨著植物基因工程技術的不斷發展和完善，人們（men）對蔬菜基因工程育種的研究日益增多，在蔬（shū）菜抗病、抗（kàng）蟲、改善品質（zhì）及提高產量等方麵取得了階段性進展。

在目前的轉基（jī）因技術（shù）中，對轉化植株進行篩選往往采用抗性選擇標記，如抗生素類或除草劑類抗性基因等。轉基因（yīn）植株一（yī）旦再生成功，這些（xiē）抗性標記基（jī）因常與目的基因共轉化並整合到植物基因組中，由此引發環境和食品安全性問題[1-2]；且在抗性選擇劑的作用下，轉化細胞成活下來（lái），非轉化（huà）細胞被殺死，因其在逐漸凋亡過程中能夠（gòu）分（fèn）泌毒素或生長（zhǎng）抑製劑，進而造成轉基因體係（xì）的轉化（huà）效（xiào）率低[1]。鑒於這些情況，培育出轉化（huà）效率高（gāo）的（de）生物安全（quán）標記基因的轉基因植物，已成為目前基因工（gōng）程的重要目標。

2、基於糖代（dài）謝相關基因的正向選擇係（xì）統

2.1、糖代謝相關（guān）基因種類及選擇優勢

安全標記基因是對生態環境和人類健（jiàn）康相對安全的標記基因。研究較多的生物安全標記基因主要是與糖類代謝相關的（de）基因，如磷酸甘露糖異構酶（méi）基因（pmi）、木糖（táng）異構酶基因（xylA）和核糖醇操縱子（rtl）等[3]。與糖代（dài）謝相關基（jī）因的轉化係統不是將非轉化細胞殺死，而是導入（rù）特定的基因使轉化細胞具備特定的代謝優勢或利用特定的物質，使之生長旺盛，從而達到（dào）篩選效果[4]。與常規標記基因（yīn）不同，糖代謝相關基因具有以下優（yōu）點（diǎn）：這些（xiē）標記（jì）不具有抗（kàng）性，基因本身及表達產物無毒（dú）副作（zuò）用，因此（cǐ）不必擔心環境安全和人類健康等問題；轉化體係有利於植株再生，轉化率高[5]。目前（qián）應用較多的是（shì）磷酸甘露糖異構酶（méi）基因，已廣泛用（yòng）於水稻、玉米、小麥、甜（tián）菜、棉（mián）花和番茄等植物轉化係統[1]。近（jìn）年來，木糖異（yì）構酶基因也（yě）得到初步（bù）應用。

2.2、木糖選擇係統的篩選機（jī）理及應用

木（mù）糖異構酶基因（xylose isomerase gene，xylA），來源於紅色鏈黴菌、高溫厭氧芽孢杆菌（jun1），編碼木糖異構酶基因，能催化（huà）D-木（mù）糖與D-木酮（tóng）糖的互變異構（圖1）[6]。

許多植物細胞可利用木酮糖作為主要碳源，但不能利用木糖。在含木糖的篩選培養基上，整合有（yǒu）外源xylA基因（yīn）的細胞（bāo）產（chǎn）生木糖異構酶能催化木糖異構為D-木酮糖，經磷酸戊糖途徑分解代（dài）謝，為轉化細（xì）胞生（shēng）長所利（lì）用，而非轉化細胞則因碳饑餓而不能正常生長[7]。用食品工業中常用的木糖作為植物轉化細胞的篩選標記（jì）是安全（quán）的。

Haldrup等[8]首先應用D-木糖作為選（xuǎn）擇劑在煙草遺傳轉化上獲得成功。韋正乙應用來源於大腸杆菌的木糖（táng）異構酶基因作為選擇標記基因，建立了農杆菌介導的基於木糖選擇（zé）係統的百脈根轉化體係。實驗對比了木糖篩選係統和除草劑篩選係統，在（zài）時間方麵，木糖選擇係統獲得轉基（jī）因再生苗（miáo）要比除草劑篩選係統縮短10 d以上[9]。

3、木糖篩選係統在蔬菜遺傳轉化（huà）上的應用

以木糖作為篩（shāi）選劑的無（wú）抗性選擇（zé）標記技術（shù）是目前轉基（jī）因（yīn）研究的（de）前沿。自1995年Vieille等[10]成功克隆並表達了木糖異構酶基因（yīn）後，以木糖作（zuò）為篩選劑的遺傳轉化已（yǐ）在多種（zhǒng）糧食作物上（shàng）得到深入研究，但在蔬菜上的應用卻十（shí）分有限。

Haldrup等[8]將木糖異構酶基因通過農杆菌介導，成功（gōng）地轉（zhuǎn）化到馬鈴薯（shǔ）、番茄的愈傷（shāng）組（zǔ）織中，然（rán）後將愈傷（shāng）組織置（zhì）於含（hán）有木糖的培養基中（zhōng）進行篩選，得到了（le）能在該培養基中正常生長的轉基（jī）因（yīn）植株。應用木糖作為篩（shāi）選劑的轉化效率大致為18%～32%，明顯高於應用卡那黴素篩選的轉化率（4%～6%）。Haldrup等（děng）[11]最終確定以（yǐ）木糖（táng）作為篩選劑在番茄上進行遺傳轉化的碳源最佳配方為不含蔗糖，且D-木糖濃度為15 g/L，應用此配比的轉化率可達9%，而用抗性標記選擇的轉化率僅為（wéi）7%；馬鈴薯最適篩（shāi）選配比（bǐ）為蔗糖7.5 g/L、木糖（táng）3.75 g/L，應用（yòng）此配比的轉化效（xiào）率（lǜ）比用卡那黴素作為選擇標記時（shí）高9倍，轉基因植株中木糖異構酶活性為非（fēi）轉基因植株的5 ～25倍（bèi）[12]。在不同作物中，木糖的篩選濃度有所差別，且轉化率也有不同。

崔麗巍[13]以大腸杆菌xylA作為選擇（zé）標記基因（yīn），利用木（mù）糖作為選擇劑獲得能夠表達帶有GUS報告基因的轉基因黃瓜，同時還構建了pX390-scFv載體，初步建立了農杆菌介導的基於木糖選擇係統的黃瓜轉化體係。最終確定（dìng）選擇在培養基中加入 15 g/L 的木糖和 15 g/L的蔗糖，能獲得（dé）較高的轉化（huà）效率。

4、小結與展望

近年來，以糖（táng）代謝相關基因作為選擇標（biāo）記的（de）正向選（xuǎn）擇係統得（dé）以迅速發（fā）展，目前應用較多的（de）是磷酸甘露糖異構酶基因，而（ér）木糖異構酶標記（jì）基因應用相（xiàng）對較少，但已證明（míng）在植物遺傳轉化上是（shì）安全、有效的。

目前，筆者（zhě）已經成功構建基於木糖異構酶（méi）標記基因的植物表達載體，並在馬鈴薯上應用D-木糖成功進行了遺傳轉化，建立了一套安（ān）全（quán）且轉化率高的馬鈴薯轉基因體係。在此工作基礎上，將著力建立辣椒、黃瓜等受基因型限製、轉化效率低的蔬菜作物遺（yí）傳轉化體係，提高蔬菜作物遺傳轉化效率，緩解因（yīn）轉基（jī）因食品安全性問題帶（dài）來的（de）困境，促進蔬菜基因工程育種工作（zuò）健（jiàn）康發展。

參考文獻

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