天然水蛭素的作用

水（shuǐ）蛭素是水蛭所含主要有（yǒu）效成分。1884年習·B．Hay-craft首先從醫用（yòng）水蛭的提取（qǔ）物中發現了這種抗凝（níng）血的物（wù）質；1904年，Jacoby將這種抗凝血的物質定名為水蛭素；1955年，Markwardt確定水蛭素為65個氨基酸的（de）肽，是血栓形成（chéng）的一種特異抑製劑；1976年（nián），Petersen等闡述了水蛭素的氨基酸序列，在其Val—Val氨基末端第63位上為硫化蛋（dàn）氨酸；1980年，Baskova等從水蛀頭部提取的水蛭素中（zhōng）確定了一個11e—Val氨基末（mò）端；1984年，Dodt等確（què）定了Petersen的Val—Val序列，同時發現了兩種（zhǒng）變異體。其中一（yī）種稱為水蛭素PA，另一變異體尚未（wèi）弄清。水蛭素PA有66個氨基酸劇末（mò）端帶Ile-Thr。Brauer等描述了另（lìng）一種有較長氨基酸鏈的變（biàn）異。所有變異都由65或66個氨基酸組成（chéng），第63位為含硫蛋氨酸。

1．結構特點

(1)水蛭素的結構：

水蛭素（sù）是水蛭刺傷人時從口腔腺體中分泌出的一種抗凝血物質，導致刺傷局部出現（xiàn）流血不（bú）止（zhǐ）的（de）現象，便（biàn）於水蛭吸吮血液。藥用水蛭（zhì）素是灰白色粉末，由HirudomedicinaisL提取精製所得，為多種氨基酸殘基組成的（de）單鏈多肽。肽鏈中不含精氨酸（suān）、甲硫氨酸和色氨酸。六個半胱氨酸組成的三（sān）個二（èr）硫橋位於肽鏈的（de）N端區域，酸性氨基酸集（jí）中在C端（duān）區域（yù），在C末（mò）端的最後九個氨基酸殘基中有五個酸性氨基（jī）酸，並有一個硫酸化的酪氨酸。肽鏈中部還有一個由Pro—Lys47—Pro組成的特殊序列。

核磁（cí）共（gòng）振（zhèn）研究表明，在水蛭素多肽鏈中無n—螺旋結構（gòu），並把（bǎ）水蛭素分子分成三個區域，一個突出的指區(31—36氨基酸殘基構成（chéng）)，一個暴露的環區(47—55氨基酸殘基構成)，一個中心核區（qū）(由3—30、33—46和56—57氨基酸殘基構成)。通過二硫橋集結而（ér）成（chéng）的，N端是疏水的，而C端是親水的，遊離在分子的表麵。水（shuǐ）蛭素的CD譜不（bú）能用傳統的蛋白質二級結構的三個成分(n—螺旋、良折疊和無序結構)來說明。實驗表明，橢圓率在200和240nm之間的變化，不（bú）是因為（wéi）。—螺旋，而可能是三個二硫橋和Tyr—SO，的貢獻。

(2)水蛭素的組成：

水蛭（zhì）素由門（mén）冬氨酸(16)、穀氨酸(13)、半胱氨酸(6)、絲氨酸(4)、甘氨酸(9)、蘇氨酸(4)、丙氨酸(1)、纈氨酸(3)、亮（liàng）氨酸(4)、異（yì）亮氨酸(2)、脯（pú）氨酸(2)、苯丙氨（ān）酸(2)、酪氨酸(2)、組氨酸(1)、賴氨酸(4)等15種74個分子、68個分子或65個分子氨基酸組成。分子（zǐ）量為2000、7000或852的蛋白質水解物。分子式CaoH600zoN。，也有（yǒu）的認為分子量為13000。分子量在7000左右者認為分子中含有三個二硫鍵。水蛭素在肽鏈N末端有一白氨酸或異白（bái）氨酸群。分子中含有大比例（lì）的（de）二羥基氨（ān）基酸（suān）類，所以呈酸性反應（yīng），但組成中（zhōng）無色氨酸（suān）、甲硫氨酸和精氨（ān）酸。等電點pH為3．8(4．0)。目前已分離出7種水蛭素的異構體，純的水蛭素常常以多聚體的（de）形式存在。

2．構效關係

(1)結構與功能（néng）的關係：

水蛭素的二級和三級結（jié）構對其抗凝活（huó）性起決（jué）定作用。二硫鍵（jiàn）是決（jué）定其分子結構（gòu）的穩定性，保持高度抗（kàng）凝活性的關鍵部分。當二硫鍵被氧（yǎng）化或還原，或分子中發生（shēng）了（le）蛋白質降解，則失去抗凝活性。若分子的羧基被酯（zhǐ）化或失去酸性（xìng）的（de）C端氨基酸，也會失去與凝血酶結合的能力（lì）。研（yán）究揭示，水蛭素與凝血酶活性位置結合的（de）結構（gòu）單元，僅存在於C端殘基中。而水蛭素的N端雖無與凝（níng）血酶結合的位置，但結合到凝血酶上的水蛭素的N端的殘基（jī）亦有抑（yì）製凝血酶催化（huà）活性作用。在研究水蛭素N端構型對其同凝血酶作（zuò）用的影響時，發現N端（duān）殘基的疏水性結構對水蛭（zhì）素抗凝血酶作（zuò）用有重要影響。肽鏈中由（yóu）Pro-Lys47—Pro組（zǔ）成的特殊序列（liè），不被一般蛋白（bái）酶所（suǒ）降解，這（zhè）個特殊結構在水蛭素與凝血酶的相互作用中具有重要的功能。

(2)肽鏈對水蛭（zhì）素活性的影響：

Dodt等人研究發現，羧端縮（suō）短了三個氨基（jī）酸殘基（jī）的水蛭素與凝血酶的反應（yīng），其抑製常（cháng）數Ki增加（jiā）了15—20倍。用滴定法測定進一（yī）步證明，縮短了6或8個羧端氨基（jī）酸，將大大降低水（shuǐ）蛭素的抑製活力，刪去9個氨（ān）基（jī）酸以上的水蛭（zhì）素幾（jǐ）乎失去全部抑製活力。很明顯，水蛭素的羧（suō）端對其抑製活（huó）力有重要影（yǐng）響。根據這（zhè）些結果推（tuī）測，水蛭素與凝血（xuè）酶之間緊密複合（hé）物的形成，要（yào）求羧端氨基酸與反應位點(Pro—Lys+，—Pro)之間（jiān）要有適當的距離，而羧端的（de）縮短可（kě）能引起水蛭素分子構型的改（gǎi）變，導致蛋（dàn）白酶與抑製劑之間的相互作用減弱。羧端第63位酪氨酸（suān）殘基的去硫酸（suān）化對水蛭素的抑製（zhì）活力也（yě）有影響，其結果與羧端縮短了三個氨基酸的水蛭素的效應相同。但是，全部去硫酸化的水蛭素仍保持著最初活力的45％。這種硫酸化的功能尚（shàng）不十分清楚，它可能涉（shè）及到與凝血酶的直接作用（yòng），或是穩定水蛭素的結構。動力學研究表明，在所有情況下，解離常數的增加（jiā），是由於結合常數減少所致，實驗再次（cì）證明水蛭素酸性的羧端區對（duì）其與凝血酶的相互作用的影響是至夭重要的。

(3)水蛭素與凝血（xuè）酶：

水蛭素與凝血酶相互作用的研究發（fā）現，水蛭素分子二硫橋的氧化（huà）與還原，蛋白水（shuǐ）解酶的降解作用，重要氨基酸的突變，都會引起水蛭素分子二級和三級結構的改變，嚴重影（yǐng）響水蛭素抗凝活性。為說明水蛭素與凝血酶（méi）相互作用的（de）機理，除了要了解水蛭素分子的結構（gòu）特（tè）點外，還必須掌握凝血酶的性質，它的哪些部位與（yǔ）水蛭素起反應。目前認為，凝血酶是由三個功能（néng）截然（rán）不同的區域組成（chéng），即所謂原發（fā）特性口袋(凝血酶的催化點在此)、非極性的結合位點和陰離（lí）子結（jié）合區域（yù）(它負責與纖維蛋白原的相（xiàng）互作用)。那麽，水蛭素（sù）與凝血酶之間是如何相互作（zuò）用的呢（ne）?研究表明，被二硫橋所穩定的水蛭素分子的氨基末端（duān）與酶的非極性結合位點（diǎn）有關係，其中的二氨基吖啶被水蛭（zhì）素所取代。水蛭素分子（zǐ）羧端則結合到酶（méi）的陰離子結合部位。被認為是水蛭素（sù）的反應位點的堿性側鏈，主要是指Pro-Lys47—Pro占據了（le）酶的特性口袋部（bù）位。但（dàn）是，水蛭素不同於其它已知的絲氨酸蛋白酶抑製劑蛋白，凝（níng）血酶並非（fēi）強烈地（dì）依賴於（yú）抑製劑蛋白的這一假（jiǎ）定（dìng）的反應位點，可能還有獨立於反應位點的其它識別結合位點。水（shuǐ）蛭素與凝血酶（méi）特異（yì）地相互作用的更詳細區域（yù）有待於深入研究。

3．水蛭素的穩定性

水蛭素在幹燥狀態下是穩定的。於室溫下在水溶液中可穩（wěn）定（dìng）6個月，80~C下加熱15分鍾不被破壞。提高pH值，則穩定性降低。胰蛋白酶鈉和。—糜蛋白（bái）酶不破壞水蛭素的活性，而番（fān）木瓜蛋白酶、胃蛋（dàn）白酶和（hé）枯（kū）草杆菌蛋白酶A可使水蛭素失去活性。所以，水蛭素一般不受熱和乙醇的（de）破壞，對於製劑生產（chǎn）是有利的。